Руководитель проекта: Абельденов Сайлау Касенович
Исполнители проекта:
Организация: Товарищество с ограниченной ответственностью "Национальный центр биотехнологии"
Инвентарный номер: 0322РК00448
Регистрационный номер: 0121РК00180
Ключевые слова: ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ,НУКЛЕАЗА,ПАТОГЕН,РЕКОМБИНАНТНЫЙ БЕЛОК,ФЕРМЕНТ
3. crРНК синтезировали с помощью Т7 РНК-полимеразы с последующей обработкой ДНКазой I. Последовательности ДНК (68-меры), содержащие промотор Т7, синтезировали и отжигали с образованием матриц двухцепочечной ДНК для транскрипции in vitro. Последовательности, соответствующие как PAM, так и не-PAM участкам, были клонированы в вектор pGEM-T и лигированы лигазой T4. Анализы коллатеральной активности транс-расщепления Cas12a на основе флуоресценции, проводили в следующих условиях: 100 нМ Cas12a, 100нМ крРНК, 2,5 мкМ флуоресцентной репортерной молекулы (5’FAM-TTATT-3’). В результате было определено, что при инкубации рибонуклеопроинового комплекса crРНК-Cas12a с целевой последовательностью различных субстратов, содержащих PAM-участок 5’-TTTA-3’, происходило расщепление дцДНК в заданном положении. Таким образом, в качестве последовательности PAM-участка для ферментов Cas12a Moraxella bovis и Moraxella equi были определены субстраты, содержащие PAM-участок 5’-TTTN-3’.
4. Оптимизированы условия биохимической реакции (температура и время реакции, концентрация компонентов реакции, состав реакционного буфера). Определена активность эндонуклеазы Cas12a относительно различных субстратов. Получены флуоресцентно-меченые олигонуклеотиды. Скрининг условий выполняли с использованием коммерческих растворов из наборов Index HT, PEG/Ion HT компании Hampton Research и ProPlex компании Molecular Dimensions в 96-луночных планшетах методом диффузии в паре «висячей капли» для кристаллизации.
